原代细胞培养攻略,学会正确操作,成功培养高质量细胞

本文主要是介绍原代细胞培养攻略,学会正确操作,成功培养高质量细胞,希望对大家解决编程问题提供一定的参考价值,需要的开发者们随着小编来一起学习吧!

实验原理
鼠胚原代培养是一种原代培养类型,指从孕鼠中取出合适胎龄的胎鼠,从特定组织中分离出细胞,并在适宜条件下进行增殖培养,直到它们占据所有可用的基质(即达到汇合状态)。在此阶段,必须将细胞转移到含有新鲜生长培养基的新容器中进行继代培养(即传代),以提供更多的继续生长空间。

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实验步骤
1、鼠胚原代培养:
1.在做实验之前,需要将超净工作台或生物安全柜的紫外灯提前照射30分钟。
1.2.实验材料准备:采用怀孕的母鼠作为材料,采用颈椎脱臼的方式进行安乐死,然后把整个鼠体浸泡在盛有纯酒精的烧杯中,时间为1分钟。随后将母鼠放置在不锈钢手术盘里,采用无菌手术剪打开其腹腔,取出鼠胚并放入无菌培养皿中。请注意,取样过程应在无菌操作台外进行。
1.用70-75%的酒精擦拭装有鼠胚的培养皿外围后,将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中。采用含有双抗Hanks液的洗涤鼠胚,并进行多次洗涤以去除血液污渍。在体视显微镜下进行操作,采用无菌手术器械去除过多组织,并用解剖镊剖取所需要的组织。将组织转移到含有解离液或培养基的50ml离心管中,采用眼科剪将组织剪碎成1立方毫米的肉糜状。
1.将解离液或培养基加入含有组织的50毫升离心管中,直至达到10毫升容量。首先采用10毫升弯头滴管对组织进行5-10次的吹打操作,然后使用1毫升的枪头对组织吹打,最后采用200微升的尖端进行吹打。
1.将上述组织悬液采用70μm过滤器过滤,以切碎和分散组织悬浮液,然后以l200rpm的速度,在4℃下离心10分钟。
1.将以前的培养基弃掉,用预先配好的培养基重悬细胞,并接种到经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中。把它置于37℃、5%CO2培养箱中,三天后更换培养液。之后每两天需要更换细胞培养液。

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传代培养
2.在进行实验之前,一定要提前将超净工作台或生物安全柜的紫外灯照射30分钟以确保清洁。同时,在进行实验时,还需要用酒精擦拭消毒双手。
2.将原有培养的细胞培养瓶倒置放在显微镜下,仔细观察细胞的形态,以确定是否需要进一步进行传代培养。
2.1.采用酒精棉球擦拭操作台,点燃酒精灯,将培养瓶口火烧消毒;
2.用酒精棉球清洁操作台,点亮酒精灯,让培养瓶口经过火烧消毒;
3.利用酒精棉球擦拭操作台,将酒精灯点燃,用火烧消毒培养瓶口;
4.采用酒精棉球清洁操作台,点燃酒精灯,将培养瓶口进行灼烧消毒;
5.用酒精棉球擦拭操作台,将酒精灯点燃,对培养瓶口进行火烧消毒;
2.倒掉培养瓶中的旧培养基,并保留贴壁生长的细胞。
2.在培养瓶中加入适量0.25%的胰酶,让其刚好覆盖住贴壁生长的细胞。然后拧紧瓶盖,将培养瓶放入37℃的培养箱中,保持5分钟时间。在这段时间里,如果通过显微镜观察,可以看到细胞的突起会收回,并变成圆形。
2.取出培养瓶后,轻轻地摇动或吹打培养瓶,使细胞从瓶壁上脱离,然后把细胞悬液转移到离心管中。将离心管放在4℃的离心机中,以800rpm的速度离心5分钟。
2.将离心管中的上清弃掉,然后把细胞悬浮在细胞培养基中,接着把它移植到经过多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中。之后,将培养瓶或培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。这样,细胞便可以继续分裂并传代。

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注意事项
1、进行原代培养时,请注意以下事项:
1)在进行原代培养时,要特别注意无菌操作,并在采用之前对工具进行高压灭菌处理。
2)由于鼠胚原代培养时,因为组织较少,所以建议在冷光源体视显微镜下进行操作;
3)原代细胞培养过程时间比较长,最短需要一周以上的时间。如果在培养2天后,培养基出现发黄现象,并且没有漂浮物,可以排除污染,是很正常的现象,是由于细胞在贴壁生长过程中所释放出来的。

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