AAT Bioquest/艾美捷ReadiView™ 生物素琥珀酰亚胺酯样品实验方案

虽然市面上有大量的生物素标记的生物偶联物，但准确测定生物素化程度（生物素/生物聚合物的比例）仍然是生物化学家面临的一大挑战。HABA仍然主要用于确定生物素化程度（通过其吸收，消光系数= 34,000 / M-1cm-1）。当添加含生物素的样品时，生物素与亲和素强烈结合，并取代弱结合的 HABA。由此产生的吸光度降低与生物素的量有关。然而，影响HABA方法准确性的因素很多，使得该方法对于许多生物素标记的偶联物不可靠。

AAT Bioquest的 ReadiView™ 生物素含有专门设计的色标 （CT），只需计算 280 nm/385 nm 的校正吸收率，即可轻松获得生物素化程度。我们专门设计的标签对生物素结合亲和力的影响非常小，其吸收最大值旨在使标签对用于标记亲和素的大多数荧光基团具有极小的淬灭作用。

AAT Bioquest /艾美捷ReadiView™ 生物素琥珀酰亚胺酯样品实验方案：

该标记方案是针对山羊抗小鼠 IgG 与 ReadiView™ 生物素琥珀酰亚胺酯的偶联物而开发的。您可能需要对特定蛋白质进行进一步优化。注意：每种蛋白质都需要不同的 ReadiView 生物素琥珀酰亚胺酯/蛋白质比例，这也取决于 ReadiView™™ 生物素琥珀酰亚胺酯的特性。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低 ReadiView™ 生物素琥珀酰亚胺酯/蛋白质比率的蛋白质偶联物会降低灵敏度。

运行偶联反应

以10：1摩尔比的溶液B（ReadiView™生物素琥珀酰亚胺酯）/溶液A（蛋白质）为起点：将5μL的ReadiView生物素琥珀酰亚胺酯储备溶液（溶液B，假设ReadiView™™生物素琥珀酰亚胺酯储备溶液为10mM）加入蛋白质溶液（95μL溶液A）的小瓶中，有效振荡。假设蛋白质浓度为10mg / mL，蛋白质分子量为~200KD，则蛋白质的浓度为~0.05mM。注意：我们建议使用10：1摩尔比的溶液B（ReadiView™生物素琥珀酰亚胺酯）/溶液A（蛋白质）。如果太少或太高，则分别确定 5：1、15：1 和 20：1 的最佳 ReadiView™ 生物素琥珀酰亚胺酯/蛋白质比例。

在室温下继续旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。

纯化偶联物

以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化的染料-蛋白偶联物的示例。

根据制造说明制备Sephadex G-25色谱柱。

将反应混合物（从“运行偶联反应”）加载到 Sephadex G-25 色谱柱的顶部。

一旦样品在顶部树脂表面下方流动，立即加入 PBS （pH 7.2-7.4）。

向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。合并含有所需 ReadiView™ 生物素-蛋白偶联物的馏分。注意：为了立即使用，ReadiView™生物素-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装用于多种用途。注意：如需长期储存，ReadiView™ 生物素-蛋白质偶联溶液需要浓缩或冷冻干燥。

AAT Bioquest ReadiView™ 生物素琥珀酰亚胺酯图像示例：

图 1.ReadiView™生物素琥珀酰亚胺酯的结构，嵌入了偶联TAG。这种嵌入的TAT可以很容易地通过其紫外吸收来监测，这与蛋白质的280 nm吸收不同。TAG不淬灭常用荧光染料的荧光，对亲和素结合的影响很小。

AAT Bioquest ReadiView™ 生物素琥珀酰亚胺酯部分文献引用：

Evaluation of a new biotin-DOTA conjugate for pretargeted antibody-guided radioimmunotherapy (PAGRIT((R)))

Authors: Urbano N, Papi S, Ginanneschi M, De Santis R, Pace S, Lindstedt R, Ferrari L, Choi S, Paganelli G, Chinol M.

Journal: Eur J Nucl Med Mol Imaging. (2006)

A biotin-protein bond with stability in plasma

Authors: Bogusiewicz A, Mock NI, Mock DM.

Journal: Anal Biochem (2005): 98

Instability of the biotin-protein bond in human plasma

Authors: Bogusiewicz A, Mock NI, Mock DM.

Journal: Anal Biochem (2004): 156

Design, synthesis, and evaluation of 5'-S-aminoethyl-N(6)- azidobenzyl-5'-thioadenosine biotin conjugate: a bifunctional photoaffinity probe for the es nucleoside transporter

Authors: Addo JK, Buolamwini JK.

Journal: Bioconjug Chem (2004): 536