Jackson ImmunoResearch蛋白质印迹指南：膜封闭

封闭对于防止转移的蛋白质、膜和实验中使用的后续试剂之间的非特异性相互作用至关重要。非特异性结合会产生背景信号，从而干扰结果解释。Jackson ImmunoResearch艾美捷教你如何选择合适的封闭试剂。

封闭试剂的选择取决于蛋白质印迹检测步骤中使用的二抗的种类。

蛋白封闭剂

封闭溶液的蛋白质成分应与被检测的抗原和二抗的种类相容。

牛血清白蛋白 (BSA) 和脱脂奶粉通常用于封闭溶液，因为它们既便宜又容易获得。然而，它们并不总是合适的，并且可能是背景的原因。

当使用针对来自牛或相关物种（如羊驼、山羊、马或绵羊）的抗体的抗体时，应避免使用 BSA 和脱脂奶粉。在许多 BSA 制剂中发现低水平的牛免疫球蛋白 G (IgG)。

建议使用来自标记二抗宿主物种的正常血清作为较佳封闭剂，以避免任何不必要的相互作用。使用前应制备新鲜的血清工作溶液，通常在浸入膜之前在所选缓冲液中稀释至 5% w/v。

缓冲溶液

通常使用 pH 范围高于大多数抗体（pH 范围 7.5-8.5）的等电点 (pI) 的缓冲溶液，例如 Tris 缓冲盐水 (TBS) 或磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。如果磷酸化蛋白是印迹的焦点，则不推荐使用 PBS。

这是因为一抗可以与缓冲液中的磷酸盐以及靶蛋白结合。还应考虑缓冲液 pH 值对检测步骤中使用的报告酶（例如碱性磷酸酶）活性的影响。

非离子洗涤剂

非离子去污剂通常包含在蛋白质印迹中使用的缓冲液中。它们可以防止聚集，这本身会导致背景，但也可以绑定到可能导致非特定交互的任何站点。

Tween-20™（通常为 0.1%）通常用作缓冲添加剂。

Jackson ImmunoResearch艾美捷 关于孵化时间和洗涤问题：

应确定实现较佳信噪比所需的最短可能阻塞持续时间。虽然在 4°C 下过夜封闭可能很有吸引力，但过度封闭孵育会导致聚集和细菌生长，这可能会导致背景或干扰可视化。

封闭过程可能需要通过改变组分及其浓度、时间和温度来进行优化，以获得比较低的背景和比较高的信噪比。

值得注意的是，在封闭后用不含其蛋白质成分的缓冲液清洗膜很重要，因为它可以改善一抗对抗原表位的访问。

注意：专有的阻塞解决方案

有几种预配制的封闭溶液可供使用，它们在市场上销售时适用于所有实验条件。情况可能并非总是如此，尽管它们可能足以满足一组条件。重要的是要考虑后续试剂的种类可能会排除使用通用封闭溶液，并且使用标记抗体种类的正常血清可能更可靠。

注意：用 BSA 或牛奶封闭

牛血清白蛋白 (BSA) 和奶粉可能含有牛 IgG。抗羊驼、抗牛、抗山羊、抗马和抗羊抗体会与牛 IgG 发生反应。使用 BSA 或奶粉进行封闭或稀释可能会显着增加背景和/或降低抗体滴度，应避免使用具有这些特异性的抗体；使用标记二抗宿主物种的正常血清 (5% v/v)。如果 BSA 被视为封闭剂，请使用不含 IgG 的试剂以降低背景电位。

Jackson ImmunoResearch艾美捷相关参考方案：

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